简介:饲料中氨基酸含量的检测是必须的，因为氨基酸检测分析是饲料中含氮量测定和蛋白质含量测定的一种重要辅助手段，随着反相色谱技术的发展，采用反相HPLC色谱测定氨基酸越来越普遍。

       本文使用Venusil-AA氨基酸分析方法包建立了饲料中氨基酸分析的高效液相色谱法HPLC方法，在50-1250nmol/mL的浓度范围内，18种氨基酸具有良好的线性范围，相关系数r大于0.999，检测限约为5pmol，具有良好的重复性和稳定性，并且通过使用不同的HPLC仪器验证了该方法具有良好的耐用性。

以下是高效液相色谱(HPLC)检测饲料中氨基酸含量的测定方法详细说明：

1.仪器
高效液相色谱仪LC-10ADvp（岛津），SPD-10Tvp（岛津）检测器实验室用样品粉碎机；样品筛: 孔径0.25mm；离心机；真空泵 ；恒温干燥箱；水解管。

 2.试剂
  盐酸（优级纯）；
  无水醋酸钠（分析纯）；
  冰醋酸（分析纯）；
  乙腈（色谱纯）；
  去离子水；

3.实验条件
 色谱柱：氨基酸分析专用柱（100Å，4.6mm×250mm ，5μm）
  检测波长：254 nm；
  柱温：40℃    
  流动相A：称取15.2g无水醋酸钠，加水1850mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，    
  加乙腈140mL，混匀，用0.45µm滤膜过滤。   
  流动相B：80%（V/V）乙腈水溶液，
  进样量：5µL    
  流速：1mL/min，梯度洗脱      
 时间（min） A% B%
0  100 0
11  93 7
13.9 88 12
14 85 15
29 66 34
32 30 70
35 0 100
42 0 100
45 100 0
60 100 0

        饲料游离氨基酸含量测定样品溶液制备  准确称取适量饲料（使样品中需测定的单个氨基酸含量在5～10mg或总氨基酸含量在100-150mg范围内），置于烧杯中，加0.1 mol/L盐酸30mL，搅拌提取15 min，静置5分钟，将上清液过滤到100 mL容量瓶中，残渣加0.1 mol/L盐酸25mL,搅拌3 min，重复提取两次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用水冲洗滤纸上的残渣，收集滤液并加0.1mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。

        氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生 准确量取样品溶液200μL，置1.5mL塑料离心管中，准确加入20μL正亮氨酸内标溶液，混匀，加220μL 0.1mol/L盐酸溶解，加入三乙胺乙腈溶液100μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400μL，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45µm滤器过滤。另准确量取混合氨基酸标准溶液200μL，置于1.5mL塑料离心管中，准确加入20μL正亮氨酸内标溶液，混匀，加入三乙胺乙腈溶液100μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400μL，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45µm滤器过滤。

4.谱图